AEG 618K 8- Manuals
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User Manual AEG 618K 8
Summary
3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ........................................................................................................... 5 1.1 Die humanen Immundefizienzviren ..................................................................................... 5 1.1.1 Vorkommen und Verbreitung ...
5 1 Einleitung 1.1 Die humanen Immundefizienzviren Die humanen Immundefizienzviren (HIV) vom Typ-1 (HIV-1) und Typ-2 (HIV-2) wurden 1983 und 1986 [1,2] als verursachende Erreger der 1981 erstmalig beschriebenen [3] Immunschwächekrankheit AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) identifiziert. Der ...
6 weltweit insgesamt 34 Millionen Menschen mit HIV infiziert, die Zahl der Neuinfektionen lag bei 2,7 Millionen in jenem Jahr. Im globalen Vergleich ist Subsahara-Afrika die von HIV/AIDS am stärksten betroffene Region. Im Jahr 2010 entfielen allein zwei Drittel der Menschen, die mit einer HIV-Infekt...
7 „horizontale Transmission“ dar. Die Übertragung von HIV-1 von der Mutter auf das Kind wird als „vertikale Transmission“ bezeichnet. Ohne medizinische Intervention liegt das Risiko zwischen 25-48% [31]. Während der Schwangerschaft besteht ein Übertragungsrisiko von 5-10% (in-utero Transmission), zu...
8 1.2 Antiretrovirale Medikamente gegen HIV Seit 1987 können HIV-Infizierte mit antiretroviralen Medikamenten behandelt werden. Ziel ist die Hemmung der Virusreplikation zur Absenkung der Viruslast unter die Nachweisgrenze von 40-50 Genomkopien/ml Plasma. Dies wird heutzutage in Form einer dauerhaft...
9 Einbau in die DNA-Kette bei der Reversen Transkription. Da den NRTI die 3´-Hydroxylgruppe an der Desoxyribose fehlt, kann keine Phosphordiesterbindung zum darauffolgenden Nukleotid aufgebaut werden und es kommt zum Kettenabbruch bei der DNA-Synthese. Die NRTI sind Vorstufen der wirksamen Verbindun...
12 Die antiretroviralen Medikamente, die bis 2006 von der WHO zur Transmissionsprophylaxe vorgesehen waren (Tabelle 1), sind plazentagängige Reverse-Transkriptase-Inhibitoren [57,64]. AZT und 3TC gehören zur Wirkstoffgruppe der NRTI und NVP zu den NNRTI. AZT (Azidothymidin, Zidovudin (ZDV), Handelsn...
13 ressourcenschwachen Endemiegebiete, der Zugang zu antiretroviralen Medikamenten unterschiedlicher Wirkstoffklassen ist meist noch stark eingeschränkt [70,71]. 1.3.1 Entstehung von Resistenzen Durch den hohen Turnover von HIV (10 Milliarden neuer Viruspartikel pro Tag) [72], gekoppelt mit der hohe...
14 Abbildung 2 : Resistenzmutationen, selektiert durch die Medikamente Zidovudin, Lamivudin und Nevirapin, geändert aus Johnson et al. 2011 [78] AZT (Azidothymidin, Zidovudin (ZDV), Handelsname Retrovir®) Zunächst unter Monotherpie mit AZT [69], aber auch häufig bei Therapie mit anderen NRTI beschri...
15 3TC (Lamivudin, Dideoxy-Thiacytidin, Handelsname Epivir®) Für 3TC ist die genetische Barriere zur Resistenzentstehung gering. Bereits eine einzige Punktmutation (ATG=>GTG) in der Reversen Transkriptase führt zum Aminosäureaustausch M184V, der eine hochgradige Resistenz gegenüber 3TC verursacht...
16 Asien [94]. Das SPREAD (Strategy to Control the Spread of HIV-1) Programm ermittelte sogar eine Prävalenz von 8,4% für 20 europäische Staaten und Israel (Analysezeitraum von 2002 bis 2005) [95]. Nach der Serokonverterstudie des Robert Koch-Instituts Berlin erfolgt die Übertragung resistenter HIV ...
17 Algorithmen identifiziert und bewertet werden. Die Vorhersagetools basieren auf Regeln, die entweder auf aktuellen Literaturdaten d.h. wissensbasierten genotypischen Interpretationssystemen wie z. B. HIV-GRADE beruhen oder auf datenbasierten Interpretationssysteme aus paarweise durchgeführten Gen...
18 2 Zielsetzung Zur Prävention der Mutter-Kind Übertragung von HIV-1 (prevention of mother-to-child transmission of HIV-1; PMTCT) in der weltweit meistbetroffenen Region Subsahara- Afrika werden antiretrovirale Medikamentenregime zur Prophylaxe der vertikalen HIV- Übertragung eingesetzt. Das Vorlie...
19 AZT/3TC/NVP-selektierte Schlüsselmutationen (AZT: K70R, T215Y, T215F; 3TC: M184V; NVP: K103N, Y181C) der RT vorgesehen. Da die ASPCR jedoch auf die Detektion einzelner Punktmutationen limitiert ist, war für ausgewählte Proben eine zusätzliche Analyse mit der ultra-sensitiven Sequenzierung („ultra...
20 3 Ergebnisse 3.1 Liste aller Einzelarbeiten Manuskript I Detection and quantification of minor human immunodeficiency virus type 1 variants harboring K103N and Y181C resistance mutations in subtype A and D isolates by allele- specific real-time PCR Hauser A, Mugenyi K, Kabasinguzi R, Bluethgen K,...
22 3.3 Manuskript I Detection and quantification of minor human immunodeficiency virus type 1 variants harboring K103N and Y181C resistance mutations in subtype A and D isolates by allele-specific real-time PCR Abstract Background: Nevirapine (single dose), commonly used to prevent the mother-to-chi...
23 3.4 Manuskript II Emergence and persistence of minor drug-resistant HIV-1 variants in Ugandan women after nevirapine single-dose prophylaxis Abstract Background: Nevirapine (NVP) single-dose is still a widely used antiretroviral prophylaxis for the prevention of vertical HIV-1 transmission in res...
24 3.5 Manuskript III Dynamics of NVP-resistance development in HIV-1 of Ugandan mother-child pairs during 18 months after nevirapine single-dose exposure to reduce vertical transmission Abstract Background: A single-dose (SD) of nevirapine (NVP) is still applied in resource-limited settings to redu...
25 3.6 Manuskript IV Minor drug-resistant HIV type-1 variants in breast milk and plasma of HIV type-1- infected Ugandan women after nevirapine single-dose prophylaxis Abstract Background : Nevirapine single-dose (NVP-SD) reduces mother-to-child transmission of HIV type-1 (HIV-1), but frequently indu...
26 3.7 Manuskript V Emergence of minor drug-resistant HIV-1 variants after triple antiretroviral prophylaxis for prevention of vertical HIV-1 transmission Abstract Background: WHO-guidelines for prevention of mother-to-child transmission of HIV-1 in resource-limited settings recommend complex matern...
27 3.8 Manuskript VI Drug-resistant HIV-1 in cellular DNA of Tanzanian women following WHO- recommended antiretroviral prophylaxis for vertical transmission Abstract Background: Previously, we reported the emergence of drug-resistant HIV-1 variants in plasma of Tanzanian women after antiretroviral t...
28 3.9 Manuskript VII Minor drug-resistant HIV-1 variants in Tanzanian women after antiretroviral prophylaxis for vertical transmission detected by ultra-deep amplicon sequencing and allele-specific real-time PCR Abstract Background: As part of a feasibility study carried out between 2008 and 2009 t...
29 4 Diskussion Die zeitlich begrenzte Einnahme antiretroviraler Medikamentenregime zur Prävention der Mutter-Kind Übertragung von HIV birgt die Gefahr der Resistenzentstehung aufgrund der subtherapeutischen Wirkstoffspiegel während der Medikamenten-Ausklingphase. Besitzen diese Medikamente noch daz...
30 4.1 Vergleich von ASPCR und UDS Sensitive Resistenz-Nachweismethoden erlauben eine präzise Detektion von geringsten Anteilen an resistenten Virusvarianten in der Gesamtviruspopulation. Die Sensitivität einer Detektionsmethode ist von deren Nachweisgrenze abhängig. Die ASPCR-Assays konnten in der ...
34 4.2 Vergleich der HIV-Resistenzentstehung nach Einsatz zweier antiretroviraler Medikamentenregime zur Prävention der HIV-Transmission 4.2.1 HIV-Resistenzentstehung bei Müttern Die NVP-Einmaldosis führte im ugandischen Studienkollektiv innerhalb von drei Monaten bei 62% der Mütter zur Entstehung v...
35 Die präpartale AZT-Einnahme führte zu einer signifikanten Abnahme der Viruslast zur Geburt, nicht aber zu einer Senkung unter die Nachweisgrenze. Virusreplikationen fanden offenbar unter dem Selektionsdruck von AZT weiterhin statt und resultierten in einer signifikant häufigeren Entstehung von AZ...
36 4.2.2 Mögliche Auswirkungen der HIV-Resistenzentstehung für den Erfolg anschließender antiretroviraler Therapien Ohne medikamentösen Selektionsdruck wird die Mehrzahl der Resistenzen rasch wieder vom Wildtyp ersetzt [104-106]. Bei einem Viertel der Frauen des ugandischen Studienkollektives konnte...
38 4.2.3 Mögliche Auswirkungen der HIV-Resistenzentstehung für die vertikale Transmission von HIV Die Einführung der präpartalen AZT-Einnahme im Dreifachregime hatte eine effektivere Senkung des in-utero und intrapartalen Transmissionsrisiko durch die prophylaktische Wirkung des plazentagängigen Med...
39 4.2.4 HIV-Resistenzentstehung bei vertikal infizierten Kindern Das Auftreten von Resistenzen konnte auch bei den HIV-infizierten Kindern nach Einnahme des Prophylaxeregimes dokumentiert werden. Das Risiko für eine Resistenzentstehung in den ersten drei Lebensmonaten war in beiden Studienkollektiv...
42 5 Literatur 1. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S, et al. (1983) Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 220: 868-871. 2. Clavel F, Guyader M, Guetard D, Salle M, Montagnier L, et al. (1986) ...
45 42. Deutschen AIDS-Gesellschaft e.V./Österreichische AIDS-Gesellschaft (2010) Deutsch-Österreichische Leitlinien zur antiretroviralen Therapie der HIV-1-Infektion. Available: http://www.daignet.de/site-content/hiv-therapie/leitlinien-1/Leitlinien_28-05-2010_V_late.pdf. Accessed 10 April 2012 43. ...
55 6 Zusammenfassung Subsahara-Afrika ist die weltweit am stärksten betroffene Region von HIV/AIDS. Im Jahr 2010 entfielen ca. 68% aller HIV-Infektionen und 90% der HIV-Neuinfektionen bei Kindern (<15 Jahre) auf diese Region. Nahezu alle Infektionen von Kindern sind die Folge einer HIV-Übertragun...
58 7 Abstract Sub-Saharan Africa represents the most heavily HIV-affected region worldwide. In 2010 this region accounted for approximately 68% of all HIV-infections and 90% of new HIV infections in children (<15 years). Almost all HIV infections in children are the result of mother-to-child tran...
60 8 Liste der veröffentlichten Arbeiten Hauser A , Mugenyi K, Kabasinguzi R, Bluethgen K, Kuecherer C, Harms G, Kunz A. Detection and quantification of minor human immunodeficiency virus type 1 variants harboring K103N and Y181C resistance mutations in subtype A and D isolates by allele-specific re...
61 9 Anhang 9.1 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei all denen bedanken, die mich fachlich und moralisch in dieser Zeit unterstützt haben. Frau Prof. Dr. Gundel Harms-Zwingenberger danke ich für die Möglichkeit, ein Thema zum inhaltlichen Schwerpunkt meiner Promotionsarbeit machen zu könn...
63 9.2 Lebenslauf Der Lebenslauf ist in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten. Anhang
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Manuskript III Ergebnisse 1 Dynamics of NVP-resistance development in HIV-1 of Ugandan mother-child pairs during 18 months after nevirapine single-dose exposure to reduce vertical transmission Andrea Hauser 1,2 , Andrea Kunz 1 , Kizito Mugenyi 3 , Rose Kabasinguzi 3 , Claudia Kuecherer 2 , Gundel Ha...
Manuskript III Ergebnisse 2 Sequencing method [10] or on samples taken 4-12 weeks after birth or after treatment failure [8,15,16]. So far, the emergence and persistence of minor resistant HIV-variants in children following a NVP-SD have not been assessed. In the present study we monitored the prese...
Manuskript III Ergebnisse 3 mo nths (in case of death or loss to follow-up of the child), HIV-PCR was performed using the “outer” PCR of ASPCR [21]. In case of positive PCR-results all samples of the infected child were tested by PCR to determine the time of vertical transmission. Positive PCR- resu...
Manuskript III Ergebnisse 4 not be identified, since samples of birth and/or 2-4 weeks after were lacking. All HIV- positive infants were breastfed. Mother-child pairs were infected with HIV-1 subt ypes A1 (n=4), D (n=3), G (n=1) and K (n=1) (Table 1). For resistance testing by ASPCR, a mean of 4.4 ...
Manuskript III Ergebnisse 6 challenging: our data (despite the very small sample size) and data of Persaud et al. [34] (26% of children (n=19) with NVP-resistant HIV 6 months after NVP-SD exposure), suggest that the start of therapy within seven months cannot be recommended. Rather, the fact that re...
Manuskript III Ergebnisse 7 References 1. Guay LA, Musoke P, Fleming T, Bagenda D, Allen M, et al. (1999) Intrapartum andneonatal single-dose nevirapine co mpared with zidovudine for prevention of mother-to-child transmissio n o f HIV-1 in Kampala, Uganda: HIVNET 012 randomised trial.Lancet 354: 795...
N o . T r a n s- m is si o n S u b - ty p e D e li v e ry W ee k 2 -4 W e ek 6 -8 M o n th 3 M o n th 6 M o n th 1 2 M o n th 1 8 K 1 0 3 N Y 1 8 1 C K 1 0 3 N Y 1 8 1 C K 1 0 3 N Y 1 8 1 C K 1 0 3 N Y 1 8 1 C K 1 0 3 N Y 1 8 1 C K 1 0 3 N Y 1 8 1 C K 1 0 3 N Y 1 8 1 C 1 IU K C h il d w t w t w t w ...
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Manuskript VI Ergebnisse 2 Methods HIV-1 infected treatment-naive, pregnant Tanzanian women were recruited within a n observational study at Kyela District Hospital (KDH), Mbeya Regio n, Tanzania. According to the national Tanzanian PMTCT guidelines 2008 [10] and WHO 2006 recommendations [8] women r...
Manuskript VI Ergebnisse 5 Persistence of resistance in HIV-DNA of PBMCs may negatively impact subsequent maternal AZT-containing treatment. Hence, in the context of resistance development, full antiretroviral therapy during and after pregnancy, as recommended by WHO 2010 guidelines (Option B), shou...
Manuskript VI Ergebnisse 6 Table 1 : Drug resistant HIV-variants in plasma and PBMCs detected by ASPCR Proportion of resistance mutation delivery-2weeks 4-6 weeks 12-16 weeks No HIV-1subtype AntenatalAZT-intake(days) Plasma Plasma PBMC Plasma PBMC 046 C 40 wt wt 3.7% T215F wt - 081 C 57 - wt 19% K10...
Manuskript VI Ergebnisse 7 0 5 10 15 20 25 30 P la s m a P B M C s P la s m a P B M C s P la s m a P B M C s AZT NVP 3TC % p = 0.7p = 1.0 p= 0.7 p= 1.0 AZT (T215Y/F) AZT (K70R) NVP 3TC 0 5 10 15 20 25 30 P la s m a P B M C s P la s m a P B M C s P la s m a P B M C s AZT NVP 3TC % p = 0.7p = 1.0 p= 0...
Manuskript VI Ergebnisse 10 supplementary material: Quantification of HIV proviral DNA Proviral DNA copies were quantified in DNA extracted from buffy coat by TaqMan real- time PCR o f the HIV-1 LTR genomic region using an HIV-1 DNA concentration standard: defined copies o f HIV-1 plasmid DNA “pNL4-...
Manuskript VI Ergebnisse 11 50µl with 12.5 µl genomic DNA and (B) the cycle number in the second round PCR was reduced to 20 cycles. The result of the pre-treatment sample was used for calculation of the individual cut-off [3]. Depending on the DNA-copy input in ASPCR, a detection limit was calculat...
Manuskript VII Ergebnisse 2 Introduction Sanger population sequencing is routinely used for genotypic resistance testing of HIV-1 protease and reverse transcriptase (RT) [1,2]. However, only mutant variants present at levels above 20% in the viral quasispecies of the patient can be detected by this ...
Manuskript VII Ergebnisse 3 Materials and methods: The study cohort In a previous study, 13/50 women who had taken antiretrovial triple prophylaxis were found to carry HIV-1 variants with at least one regimen-selected resistance mutation at week 4-6 after delivery [21]. These 13 women were included ...
Manuskript VII Ergebnisse 4 Each bead provides a single sequence (read). The total number of reads obtained per genome position is termed "coverage". The number of mutant reads within the total number of reads provides the relative proportion (%) of mutant. In the present study the 13 back-u...
Manuskript VII Ergebnisse 5 a coverage of at least 50 mutant reads within 5000 total reads generated by primers of both orientations is recommended [25]. In this study, the validity criteria were modified to allow the sensitivity UDS and ASPCR to be compared: a minor variant was considered to be val...
Manuskript VII Ergebnisse 12 Table 3: Resulting prognosis for drug-resistance Pat No. Pop seq ASPCR UDS 3 - AZT AZTNVP 4 AZT AZT - 5 - - 3TC 7 - 3TC - 8 - NVP NVPAZT 9 - - - 10 - AZT AZTNVP 11 - AZT NVPAZT 12 - - NVP 13 - AZT NVP 14 - NVP - 15 - NVP NVP 16 NVP NVP NVP - = no detection AZT = Zidovudi...
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