Page 3 - Inhaltsverzeichnis
3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ........................................................................................................... 5 1.1 Die humanen Immundefizienzviren ..................................................................................... 5 1.1.1 Vorkommen und Verbreitung ...
Page 5 - Die humanen Immundefizienzviren; Eingliederung von HIV in die Familie der Retroviren.; Vorkommen und Verbreitung von HIV; Einleitung
5 1 Einleitung 1.1 Die humanen Immundefizienzviren Die humanen Immundefizienzviren (HIV) vom Typ-1 (HIV-1) und Typ-2 (HIV-2) wurden 1983 und 1986 [1,2] als verursachende Erreger der 1981 erstmalig beschriebenen [3] Immunschwächekrankheit AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) identifiziert. Der ...
Page 6 - Diversität von HIV; rekombinanten Formen führen, die als CRF (; Transmission von HIV
6 weltweit insgesamt 34 Millionen Menschen mit HIV infiziert, die Zahl der Neuinfektionen lag bei 2,7 Millionen in jenem Jahr. Im globalen Vergleich ist Subsahara-Afrika die von HIV/AIDS am stärksten betroffene Region. Im Jahr 2010 entfielen allein zwei Drittel der Menschen, die mit einer HIV-Infekt...
Page 7 - Maßnahmen zur Reduktion der vertikalen Transmission von HIV
7 „horizontale Transmission“ dar. Die Übertragung von HIV-1 von der Mutter auf das Kind wird als „vertikale Transmission“ bezeichnet. Ohne medizinische Intervention liegt das Risiko zwischen 25-48% [31]. Während der Schwangerschaft besteht ein Übertragungsrisiko von 5-10% (in-utero Transmission), zu...
Page 8 - Antiretrovirale Medikamente gegen HIV; verschiedenen Wirkstoffklassen zu Verfügung:
8 1.2 Antiretrovirale Medikamente gegen HIV Seit 1987 können HIV-Infizierte mit antiretroviralen Medikamenten behandelt werden. Ziel ist die Hemmung der Virusreplikation zur Absenkung der Viruslast unter die Nachweisgrenze von 40-50 Genomkopien/ml Plasma. Dies wird heutzutage in Form einer dauerhaft...
Page 9 - Antiretrovirale Therapie; ombined
9 Einbau in die DNA-Kette bei der Reversen Transkription. Da den NRTI die 3´-Hydroxylgruppe an der Desoxyribose fehlt, kann keine Phosphordiesterbindung zum darauffolgenden Nukleotid aufgebaut werden und es kommt zum Kettenabbruch bei der DNA-Synthese. Die NRTI sind Vorstufen der wirksamen Verbindun...
Page 12 - HIV-Resistenzen gegen antiretovirale Medikamente
12 Die antiretroviralen Medikamente, die bis 2006 von der WHO zur Transmissionsprophylaxe vorgesehen waren (Tabelle 1), sind plazentagängige Reverse-Transkriptase-Inhibitoren [57,64]. AZT und 3TC gehören zur Wirkstoffgruppe der NRTI und NVP zu den NNRTI. AZT (Azidothymidin, Zidovudin (ZDV), Handelsn...
Page 13 - Entstehung von Resistenzen; Resistenzselektion.
13 ressourcenschwachen Endemiegebiete, der Zugang zu antiretroviralen Medikamenten unterschiedlicher Wirkstoffklassen ist meist noch stark eingeschränkt [70,71]. 1.3.1 Entstehung von Resistenzen Durch den hohen Turnover von HIV (10 Milliarden neuer Viruspartikel pro Tag) [72], gekoppelt mit der hohe...
Page 14 - Abbildung 2; werden zwei Mutationspfade unterschieden: der TAM-1 Pfad mit den
14 Abbildung 2 : Resistenzmutationen, selektiert durch die Medikamente Zidovudin, Lamivudin und Nevirapin, geändert aus Johnson et al. 2011 [78] AZT (Azidothymidin, Zidovudin (ZDV), Handelsname Retrovir®) Zunächst unter Monotherpie mit AZT [69], aber auch häufig bei Therapie mit anderen NRTI beschri...
Page 15 - Übertragung und Persistenz von Resistenzen
15 3TC (Lamivudin, Dideoxy-Thiacytidin, Handelsname Epivir®) Für 3TC ist die genetische Barriere zur Resistenzentstehung gering. Bereits eine einzige Punktmutation (ATG=>GTG) in der Reversen Transkriptase führt zum Aminosäureaustausch M184V, der eine hochgradige Resistenz gegenüber 3TC verursacht...
Page 16 - ermittelte 2009 eine noch; Methoden der Resistenzbestimmung; oder mit der ultra-sensitiven Sequenzierung nachgewiesen [114]
16 Asien [94]. Das SPREAD (Strategy to Control the Spread of HIV-1) Programm ermittelte sogar eine Prävalenz von 8,4% für 20 europäische Staaten und Israel (Analysezeitraum von 2002 bis 2005) [95]. Nach der Serokonverterstudie des Robert Koch-Instituts Berlin erfolgt die Übertragung resistenter HIV ...
Page 17 - . Hier wird dem individuellen genotypischen
17 Algorithmen identifiziert und bewertet werden. Die Vorhersagetools basieren auf Regeln, die entweder auf aktuellen Literaturdaten d.h. wissensbasierten genotypischen Interpretationssystemen wie z. B. HIV-GRADE beruhen oder auf datenbasierten Interpretationssysteme aus paarweise durchgeführten Gen...
Page 18 - Zielsetzung; HIV-positiven Mütter und deren vertikal infizierte Kinder.
18 2 Zielsetzung Zur Prävention der Mutter-Kind Übertragung von HIV-1 (prevention of mother-to-child transmission of HIV-1; PMTCT) in der weltweit meistbetroffenen Region Subsahara- Afrika werden antiretrovirale Medikamentenregime zur Prophylaxe der vertikalen HIV- Übertragung eingesetzt. Das Vorlie...
Page 19 - Zielsetzung
19 AZT/3TC/NVP-selektierte Schlüsselmutationen (AZT: K70R, T215Y, T215F; 3TC: M184V; NVP: K103N, Y181C) der RT vorgesehen. Da die ASPCR jedoch auf die Detektion einzelner Punktmutationen limitiert ist, war für ausgewählte Proben eine zusätzliche Analyse mit der ultra-sensitiven Sequenzierung („ultra...
Page 20 - Ergebnisse
20 3 Ergebnisse 3.1 Liste aller Einzelarbeiten Manuskript I Detection and quantification of minor human immunodeficiency virus type 1 variants harboring K103N and Y181C resistance mutations in subtype A and D isolates by allele- specific real-time PCR Hauser A, Mugenyi K, Kabasinguzi R, Bluethgen K,...
Page 22 - detected by population-based sequencing.
22 3.3 Manuskript I Detection and quantification of minor human immunodeficiency virus type 1 variants harboring K103N and Y181C resistance mutations in subtype A and D isolates by allele-specific real-time PCR Abstract Background: Nevirapine (single dose), commonly used to prevent the mother-to-chi...
Page 23 - Nevirapine (NVP) single-dose is still a widely used antiretroviral; Methods and Findings:; NVP-resistant HIV-1 harbouring the K103N and/or Y181C
23 3.4 Manuskript II Emergence and persistence of minor drug-resistant HIV-1 variants in Ugandan women after nevirapine single-dose prophylaxis Abstract Background: Nevirapine (NVP) single-dose is still a widely used antiretroviral prophylaxis for the prevention of vertical HIV-1 transmission in res...
Page 24 - common NVP-selected resistance mutations K103N and Y181C.; Conclusions; initiated within seven months after NVP-SD exposure.
24 3.5 Manuskript III Dynamics of NVP-resistance development in HIV-1 of Ugandan mother-child pairs during 18 months after nevirapine single-dose exposure to reduce vertical transmission Abstract Background: A single-dose (SD) of nevirapine (NVP) is still applied in resource-limited settings to redu...
Page 25 - Ergebnisse
25 3.6 Manuskript IV Minor drug-resistant HIV type-1 variants in breast milk and plasma of HIV type-1- infected Ugandan women after nevirapine single-dose prophylaxis Abstract Background : Nevirapine single-dose (NVP-SD) reduces mother-to-child transmission of HIV type-1 (HIV-1), but frequently indu...
Page 26 - HIV-positive pregnant women should be considered.
26 3.7 Manuskript V Emergence of minor drug-resistant HIV-1 variants after triple antiretroviral prophylaxis for prevention of vertical HIV-1 transmission Abstract Background: WHO-guidelines for prevention of mother-to-child transmission of HIV-1 in resource-limited settings recommend complex matern...
Page 27 - combination therapy.
27 3.8 Manuskript VI Drug-resistant HIV-1 in cellular DNA of Tanzanian women following WHO- recommended antiretroviral prophylaxis for vertical transmission Abstract Background: Previously, we reported the emergence of drug-resistant HIV-1 variants in plasma of Tanzanian women after antiretroviral t...
Page 28 - As part of a feasibility study carried out between 2008 and 2009 to
28 3.9 Manuskript VII Minor drug-resistant HIV-1 variants in Tanzanian women after antiretroviral prophylaxis for vertical transmission detected by ultra-deep amplicon sequencing and allele-specific real-time PCR Abstract Background: As part of a feasibility study carried out between 2008 and 2009 t...
Page 29 - Diskussion
29 4 Diskussion Die zeitlich begrenzte Einnahme antiretroviraler Medikamentenregime zur Prävention der Mutter-Kind Übertragung von HIV birgt die Gefahr der Resistenzentstehung aufgrund der subtherapeutischen Wirkstoffspiegel während der Medikamenten-Ausklingphase. Besitzen diese Medikamente noch daz...
Page 30 - Vergleich von ASPCR und UDS
30 4.1 Vergleich von ASPCR und UDS Sensitive Resistenz-Nachweismethoden erlauben eine präzise Detektion von geringsten Anteilen an resistenten Virusvarianten in der Gesamtviruspopulation. Die Sensitivität einer Detektionsmethode ist von deren Nachweisgrenze abhängig. Die ASPCR-Assays konnten in der ...
Page 34 - Resistenzentstehung verbunden.
34 4.2 Vergleich der HIV-Resistenzentstehung nach Einsatz zweier antiretroviraler Medikamentenregime zur Prävention der HIV-Transmission 4.2.1 HIV-Resistenzentstehung bei Müttern Die NVP-Einmaldosis führte im ugandischen Studienkollektiv innerhalb von drei Monaten bei 62% der Mütter zur Entstehung v...
Page 35 - Diskussion
35 Die präpartale AZT-Einnahme führte zu einer signifikanten Abnahme der Viruslast zur Geburt, nicht aber zu einer Senkung unter die Nachweisgrenze. Virusreplikationen fanden offenbar unter dem Selektionsdruck von AZT weiterhin statt und resultierten in einer signifikant häufigeren Entstehung von AZ...
Page 36 - anschließender antiretroviraler Therapien; langfristig als Provirus persistieren. Belec
36 4.2.2 Mögliche Auswirkungen der HIV-Resistenzentstehung für den Erfolg anschließender antiretroviraler Therapien Ohne medikamentösen Selektionsdruck wird die Mehrzahl der Resistenzen rasch wieder vom Wildtyp ersetzt [104-106]. Bei einem Viertel der Frauen des ugandischen Studienkollektives konnte...
Page 38 - und Tansania gestillt wurden.
38 4.2.3 Mögliche Auswirkungen der HIV-Resistenzentstehung für die vertikale Transmission von HIV Die Einführung der präpartalen AZT-Einnahme im Dreifachregime hatte eine effektivere Senkung des in-utero und intrapartalen Transmissionsrisiko durch die prophylaktische Wirkung des plazentagängigen Med...
Page 39 - HIV-Resistenzentstehung bei vertikal infizierten Kindern; entspricht damit den Beobachtungen von Persaud; Auswirkungen
39 4.2.4 HIV-Resistenzentstehung bei vertikal infizierten Kindern Das Auftreten von Resistenzen konnte auch bei den HIV-infizierten Kindern nach Einnahme des Prophylaxeregimes dokumentiert werden. Das Risiko für eine Resistenzentstehung in den ersten drei Lebensmonaten war in beiden Studienkollektiv...
Page 42 - Literatur
42 5 Literatur 1. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S, et al. (1983) Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 220: 868-871. 2. Clavel F, Guyader M, Guetard D, Salle M, Montagnier L, et al. (1986) ...
Page 45 - Literatur
45 42. Deutschen AIDS-Gesellschaft e.V./Österreichische AIDS-Gesellschaft (2010) Deutsch-Österreichische Leitlinien zur antiretroviralen Therapie der HIV-1-Infektion. Available: http://www.daignet.de/site-content/hiv-therapie/leitlinien-1/Leitlinien_28-05-2010_V_late.pdf. Accessed 10 April 2012 43. ...
Page 55 - Zusammenfassung; Entstehung resistenter Virusvarianten.
55 6 Zusammenfassung Subsahara-Afrika ist die weltweit am stärksten betroffene Region von HIV/AIDS. Im Jahr 2010 entfielen ca. 68% aller HIV-Infektionen und 90% der HIV-Neuinfektionen bei Kindern (<15 Jahre) auf diese Region. Nahezu alle Infektionen von Kindern sind die Folge einer HIV-Übertragun...
Page 58 - Abstract; WHO recommendations have been implemented in Sub-Saharan
58 7 Abstract Sub-Saharan Africa represents the most heavily HIV-affected region worldwide. In 2010 this region accounted for approximately 68% of all HIV-infections and 90% of new HIV infections in children (<15 years). Almost all HIV infections in children are the result of mother-to-child tran...
Page 60 - Liste der veröffentlichten Arbeiten; after nevirapine single-dose prophylaxis.; Hauser A; for prevention of vertical HIV-1 transmission.
60 8 Liste der veröffentlichten Arbeiten Hauser A , Mugenyi K, Kabasinguzi R, Bluethgen K, Kuecherer C, Harms G, Kunz A. Detection and quantification of minor human immunodeficiency virus type 1 variants harboring K103N and Y181C resistance mutations in subtype A and D isolates by allele-specific re...
Page 61 - Anhang; Danksagung
61 9 Anhang 9.1 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei all denen bedanken, die mich fachlich und moralisch in dieser Zeit unterstützt haben. Frau Prof. Dr. Gundel Harms-Zwingenberger danke ich für die Möglichkeit, ein Thema zum inhaltlichen Schwerpunkt meiner Promotionsarbeit machen zu könn...
Page 63 - Lebenslauf; Anhang
63 9.2 Lebenslauf Der Lebenslauf ist in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten. Anhang
Page 64 - λ¿ ́óÌ·3» ÐÝÎ; Õ·¦·¬± Ó«1»2§·ô; ×2-¬·¬«¬» ±o Ì®±°·1⁄2¿ ́ Ó»1⁄4·1⁄2·2» ¿21⁄4 ×2¬»®2¿¬·±2¿ ́ Ø»¿ ́¬ ̧ô Ý ̧¿®·¬»
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Page 78 - transmission; Andrea Hauser; Introduction
Manuskript III Ergebnisse 1 Dynamics of NVP-resistance development in HIV-1 of Ugandan mother-child pairs during 18 months after nevirapine single-dose exposure to reduce vertical transmission Andrea Hauser 1,2 , Andrea Kunz 1 , Kizito Mugenyi 3 , Rose Kabasinguzi 3 , Claudia Kuecherer 2 , Gundel Ha...
Page 79 - Method; Study population
Manuskript III Ergebnisse 2 Sequencing method [10] or on samples taken 4-12 weeks after birth or after treatment failure [8,15,16]. So far, the emergence and persistence of minor resistant HIV-variants in children following a NVP-SD have not been assessed. In the present study we monitored the prese...
Page 80 - Results
Manuskript III Ergebnisse 3 mo nths (in case of death or loss to follow-up of the child), HIV-PCR was performed using the “outer” PCR of ASPCR [21]. In case of positive PCR-results all samples of the infected child were tested by PCR to determine the time of vertical transmission. Positive PCR- resu...
Page 81 - Discussion
Manuskript III Ergebnisse 4 not be identified, since samples of birth and/or 2-4 weeks after were lacking. All HIV- positive infants were breastfed. Mother-child pairs were infected with HIV-1 subt ypes A1 (n=4), D (n=3), G (n=1) and K (n=1) (Table 1). For resistance testing by ASPCR, a mean of 4.4 ...
Page 83 - Acknowledgements
Manuskript III Ergebnisse 6 challenging: our data (despite the very small sample size) and data of Persaud et al. [34] (26% of children (n=19) with NVP-resistant HIV 6 months after NVP-SD exposure), suggest that the start of therapy within seven months cannot be recommended. Rather, the fact that re...
Page 84 - References
Manuskript III Ergebnisse 7 References 1. Guay LA, Musoke P, Fleming T, Bagenda D, Allen M, et al. (1999) Intrapartum andneonatal single-dose nevirapine co mpared with zidovudine for prevention of mother-to-child transmissio n o f HIV-1 in Kampala, Uganda: HIVNET 012 randomised trial.Lancet 354: 795...
Page 87 - le
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Page 96 - Ï«¿2¬·o·1⁄2¿¬·±2 ±o Ø×Êóï ÎÒß 3⁄4§ ±«¬»® ÐÝÎ
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Page 104 - Methods
Manuskript VI Ergebnisse 2 Methods HIV-1 infected treatment-naive, pregnant Tanzanian women were recruited within a n observational study at Kyela District Hospital (KDH), Mbeya Regio n, Tanzania. According to the national Tanzanian PMTCT guidelines 2008 [10] and WHO 2006 recommendations [8] women r...
Page 107 - Acknowledgments
Manuskript VI Ergebnisse 5 Persistence of resistance in HIV-DNA of PBMCs may negatively impact subsequent maternal AZT-containing treatment. Hence, in the context of resistance development, full antiretroviral therapy during and after pregnancy, as recommended by WHO 2010 guidelines (Option B), shou...
Page 108 - Table 1; : Drug resistant HIV-variants in plasma and PBMCs detected by ASPCR
Manuskript VI Ergebnisse 6 Table 1 : Drug resistant HIV-variants in plasma and PBMCs detected by ASPCR Proportion of resistance mutation delivery-2weeks 4-6 weeks 12-16 weeks No HIV-1subtype AntenatalAZT-intake(days) Plasma Plasma PBMC Plasma PBMC 046 C 40 wt wt 3.7% T215F wt - 081 C 57 - wt 19% K10...
Page 109 - NVP; Figure 1
Manuskript VI Ergebnisse 7 0 5 10 15 20 25 30 P la s m a P B M C s P la s m a P B M C s P la s m a P B M C s AZT NVP 3TC % p = 0.7p = 1.0 p= 0.7 p= 1.0 AZT (T215Y/F) AZT (K70R) NVP 3TC 0 5 10 15 20 25 30 P la s m a P B M C s P la s m a P B M C s P la s m a P B M C s AZT NVP 3TC % p = 0.7p = 1.0 p= 0...
Page 112 - pol
Manuskript VI Ergebnisse 10 supplementary material: Quantification of HIV proviral DNA Proviral DNA copies were quantified in DNA extracted from buffy coat by TaqMan real- time PCR o f the HIV-1 LTR genomic region using an HIV-1 DNA concentration standard: defined copies o f HIV-1 plasmid DNA “pNL4-...
Page 113 - Population-based sequencing; J Clin Virol
Manuskript VI Ergebnisse 11 50µl with 12.5 µl genomic DNA and (B) the cycle number in the second round PCR was reduced to 20 cycles. The result of the pre-treatment sample was used for calculation of the individual cut-off [3]. Depending on the DNA-copy input in ASPCR, a detection limit was calculat...
Page 115 - Manuskript VII Ergebnisse; ASPCR and UDS using the same sample aliquot.
Manuskript VII Ergebnisse 2 Introduction Sanger population sequencing is routinely used for genotypic resistance testing of HIV-1 protease and reverse transcriptase (RT) [1,2]. However, only mutant variants present at levels above 20% in the viral quasispecies of the patient can be detected by this ...
Page 116 - Materials and methods:; The study cohort
Manuskript VII Ergebnisse 3 Materials and methods: The study cohort In a previous study, 13/50 women who had taken antiretrovial triple prophylaxis were found to carry HIV-1 variants with at least one regimen-selected resistance mutation at week 4-6 after delivery [21]. These 13 women were included ...
Page 117 - PicoGreen
Manuskript VII Ergebnisse 4 Each bead provides a single sequence (read). The total number of reads obtained per genome position is termed "coverage". The number of mutant reads within the total number of reads provides the relative proportion (%) of mutant. In the present study the 13 back-u...
Page 118 - excluded for missing regions.
Manuskript VII Ergebnisse 5 a coverage of at least 50 mutant reads within 5000 total reads generated by primers of both orientations is recommended [25]. In this study, the validity criteria were modified to allow the sensitivity UDS and ASPCR to be compared: a minor variant was considered to be val...
Page 125 - Table 3: Resulting prognosis for drug-resistance
Manuskript VII Ergebnisse 12 Table 3: Resulting prognosis for drug-resistance Pat No. Pop seq ASPCR UDS 3 - AZT AZTNVP 4 AZT AZT - 5 - - 3TC 7 - 3TC - 8 - NVP NVPAZT 9 - - - 10 - AZT AZTNVP 11 - AZT NVPAZT 12 - - NVP 13 - AZT NVP 14 - NVP - 15 - NVP NVP 16 NVP NVP NVP - = no detection AZT = Zidovudi...
